黃曲霉毒素總量免疫親和柱

使用對象

黃曲霉毒素總量免疫親和柱能夠特異性的純化與濃縮樣品中的黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2。黃曲霉毒素免疫親和柱廣泛地應用于糧食、食品、飼料、堅果、花生、醬油、醋、辣椒、胡椒、藥材和酒類等樣品的提取，該方法速度快、操作簡單、準確性高，對準確靈敏的測定樣品中中的黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2起到十分重要的作用。

黃曲霉毒素總量免疫親和柱適用于以下標準：

GB/T 18979-2003 食品中黃曲霉毒素的測定-免疫親和層析凈化高效液相色譜法和熒光光度法

SN/T 1101-2002 進出口油籽及糧谷中黃曲霉毒素的檢測方法

GBT 30955-2014 飼料中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的測定 免疫親和柱凈化-高效液相色譜法

GB/T5009.22-2016 食品中黃曲霉毒素B族和G族的測定

原理

樣品經提取液提取、過濾、稀釋，然后通過鍵合有黃曲霉毒素特殊抗體的免疫親和柱。此時，黃曲霉毒素被親和柱中的抗體特異性的吸附，用水或緩沖液將免疫親和柱上的雜質除去，然后用甲醇使抗體變性，從而將黃曲霉毒素從親和柱上洗脫下來。之后，用HPLC或熒光計進行定量檢測。

儲存條件

該親和柱保存在2-8 °C條件下，絕對不能冷凍，保質期為18個月。建議在室溫（18-30°C）下使用。

實驗溶液制備

• 提取液，甲醇/水（8+2）：取80mL甲醇加20mL水，混合均勻。
• 提取液，甲醇/水（7+3）：取70mL甲醇加30mL水，混合均勻。
• HPLC流動相，甲醇/水（45+55）：取450mL甲醇加550mL水，混合均勻，用0.22微米的尼龍篩過濾。
• 標準溶液的配制：取黃曲霉毒素混標（G1010，B1和G1為1.0ug/mL,B2和G2為0.3ug/mL），流動相為稀釋液，配制標準品溶液。例如：取100uL標準品原液于10mL容量瓶中，用10mL流動相定容至10mL，那么，黃曲霉毒素B1和G1為10ng/mL，黃曲霉毒素B2和G2為3ng/mL.

    注：配制好的標準品溶液2-8℃冷藏保存有效期為24h。

• pH 7.0 PBS溶液：稱取8.0g氯化鈉，1.44g磷酸氫二鈉，0.24g磷酸二氫鉀，0.2g氯化鉀，用990mL純水溶解，然后用濃鹽酸調節pH值至7.0，之后用純水稀釋至1000mL。
• 0.1%的吐溫/PBS：將1.0mL吐溫-20加入到1L pH 7.0 PBS溶液中，混勻。
• 1%Tween-20PBS或1%TritionX-100 PBS溶液：將10.0mL Tween-20或TritionX-100加入到1L pH 7.0 PBS溶液中，混勻。

液相色譜條件

色譜柱：Cloversil-C18 4.6*150mm（5um）或4.6*250mm（5um）

流動相：甲醇-水（45+55，v/v）

流速：0.8mL/min

檢測器：熒光檢測器，激發波長360nm,發射波長440nm

進樣體積：20~100uL

光化學衍生化系統：光化學衍生器有兩接口（不分進出），分別與色譜柱出口或熒光檢測器進口連接

 

分析步驟

1國標GB/T5009.22-2016 方法：

1.1樣品提取及稀釋：

一般固體樣品：

甲醇水提取法：準確稱取試樣5.0g于50mL離心管中，加準確加入20.0mL甲醇-水（7+3），以均質器高速攪拌提取3min或搖床震蕩20min。槽紋濾紙或普通濾紙過濾，準確移取8.0mL濾液并加入42.0mL1%Tween-20 PBS或1%TritionX-100PBS稀釋，用玻璃纖維濾紙過濾，至濾液澄清，量取25mL濾液備用。（該方法與國標方法部分改動，增加了玻璃纖維濾紙過濾；不過濾會出現堵柱子的現象）

乙腈水提取法：準確稱取試樣5.0g于50mL離心管中，加準確加入20.0mL乙腈-水（84+16），以均質器高速攪拌提取3min或搖床震蕩20min。槽紋濾紙過濾或6000RPM離心10min，準確移取4.0mL濾液并加入46.0mL1%Tween-20 PBS或1%TritionX-100PBS稀釋，備用。

1.2樣品的凈化

  一般固體樣品：

    將免疫親和柱連接于50.0mL玻璃注射器下。準確處理好的樣品濾液注入玻璃注射器中，將空氣壓力泵與玻璃注射器連接，調節壓力使溶液以約2mL/min（1滴/秒）流速緩慢通過免疫親和柱，直至2~3mL空氣通過柱體。以2-3mL/min（1-2滴/秒）流速用10.0mL水淋洗柱子2次，棄去全部流出液，并使2mL~3mL空氣通過柱體。準確加入2.0mL色譜級甲醇洗脫，將2.0mL淋洗液在50℃氮氣下吹干，用1mL流動相定容后，混勻，注入HPLC檢測。

2老國標方法：

2.1樣品提取及稀釋：

大米、玉米、小麥、堅果、調料、花生及其制品：

準確稱取試樣25.0g于250mL具塞錐形瓶中，加入5.0g氯化鈉及準確加入125.0mL甲醇-水（7+3），以均質器高速攪拌提取2min。槽紋濾紙過濾，準確移取15.0mL濾液并加入30.0mL水稀釋，用玻璃纖維濾紙過濾，至濾液澄清，備用。

植物油脂：

準確稱取試樣25.0g于250mL具塞錐形瓶中，加入5.0g氯化鈉及入125.0mL甲醇-水（7+3），以均質器高速攪拌提取2min。槽紋濾紙過濾，準確移取15.0mL濾液并加入30.0mL水稀釋，用玻璃纖維濾紙過濾，至濾液澄清，備用。

醬油：

稱取試樣50.0g于250.0mL具塞錐形瓶中，加入2.5g氯化鈉及加入甲醇-水（8+2）至100.0mL，以均質器高速攪拌提取1min。槽紋濾紙過濾，準確移取10.0mL濾液并加入40.0mL水稀釋，用玻璃纖維濾紙過濾，至濾液澄清，備用。

食醋：

準確稱取5.0g樣品，加入1.0g氯化鈉，以pH7.0磷酸鹽緩沖溶液稀釋至25.0mL，混勻，定量濾紙過濾。取10.0mL濾液加入10.0mL pH7.0磷酸鹽緩沖溶液，混勻。以玻璃纖維濾紙過濾，至濾液澄清，備用。

飼料：

準確稱取試樣50.0g于250mL具塞錐形瓶中，加入5.0g氯化鈉及入100.0mL甲醇-水（8+2），以均質器高速攪拌提取2min。槽紋濾紙過濾，準確移取10.0mL濾液并加入40.0mL pH7.0 PBS稀釋，用玻璃纖維濾紙過濾，至濾液澄清，備用。

2.2 樣品的凈化

大米、玉米、小麥、堅果、調料、花生及其制品、植物油脂：

 將免疫親和柱連接于20.0mL玻璃注射器下。準確移取15.0mL樣品提取液注入玻璃注射器中，將空氣壓力泵與玻璃注射器連接，調節壓力使溶液以約2mL/min（1滴/秒）流速緩慢通過免疫親和柱，直至2~3mL空氣通過柱體。以2-3mL/min（1-2滴/秒）流速用10.0mL水淋洗柱子2次，棄去全部流出液，并使2mL~3mL空氣通過柱體。準確加入2.0mL色譜級甲醇洗脫，流速為1 mL/min ~2mL/min（1滴/秒），收集全部洗脫液于玻璃試管中，供檢測用。

醬油和食醋： 

 將免疫親和柱連接于10.0mL玻璃注射器下。準確移取10mL樣品提取液注入玻璃注射器中，將空氣壓力泵與玻璃注射器連接，調節壓力使溶液以約2mL/min（1滴/秒）流速緩慢通過免疫親和柱。以2-3mL/min（1-2滴/秒）流速用10.0mL 0.1%的吐溫/PBS清洗，再以10.0mL水清洗柱子2次，棄去全部流出液，并使2 mL~3mL空氣通過柱體。準確加入2.0mL色譜級甲醇洗脫，流速為1mL/min~2mL/min（1滴/秒），收集全部洗脫液于玻璃試管中，供檢測用。

飼料：

將免疫親和柱連接于10.0mL玻璃注射器下。準確移取10mL樣品提取液注入玻璃注射器中，將空氣壓力泵與玻璃注射器連接，調節壓力使溶液以約2mL/min（1滴/秒）流速緩慢通過免疫親和柱。以2-3mL/min（1-2滴/秒）流速用10.0mL水清洗柱子2次，棄去全部流出液，并使2 mL~3mL空氣通過柱體。準確加入2.0mL色譜級甲醇洗脫，流速為1mL/min~2mL/min（1滴/秒），收集全部洗脫液于玻璃試管中，供檢測用。

注意事項

• 樣品添加回收試驗時，標準品添加到樣品中，靜置2小時后或過夜，再進行樣品前處理，否則會出現回收率偏低的現象。
• 不要隨便更改操作說明書中的操作步驟，如需更改要和本公司技術部聯系，確認更改是否合理。
• 操作步驟中，樣品過柱，淋洗，洗脫時，一定要控制好流速，不能太快，否則會使檢測結果偏低。
• 如果將標準品直接過柱驗證回收率時，一定要確保標準上柱液中甲醇濃度不要超過25%，否則會影響柱子的吸附能力。
• 試驗中使用的玻璃儀器等，一定要清洗干凈，尤其是用次氯酸等處理過的儀器，否則會使檢測結果偏低。

   需要準備的設備及試劑

物品

光化學衍生器

泵流操作架（配有1臺空氣泵，6個10mL針筒）

高速勻質器，轉速可達18,000 r/min ~22,000 r/min

微纖維濾紙（1.5um，100張/盒）

折疊式槽紋濾紙（100張/盒），或中速定性濾紙

一次性塑料燒杯(25/包)

一次性測試管(250支/包)

塑料漏斗(10 個/包)

黃曲霉毒素混合標準品1.0mL （B1和G1為1.0ug/mL,B2和G2為0.3ug/mL）

色譜純級的甲醇乙腈（4升/瓶）

C18 反相色譜柱4.6*150mm（5um）或4.6*250mm（5um）

玉米、飼料等基質含有不同水平黃曲霉毒素的質控樣品