黃曲霉毒素M1免疫親和柱
使用對象
免疫親和柱能夠特異性的純化牛奶及奶制品中黃曲霉毒素 M1。由于采用了先進的生物技術，該方法可以不使用有毒溶劑如氯仿和二氯甲烷檢測黃曲霉毒素M1的含量。Afla M1黃曲霉毒素免疫親和柱可以廣泛地應用于牛奶加工廠質量管理實驗室和政府檢測實驗室。此方法速度快、操作簡單、準確性高，同時能做到提高奶質，不產生污染。
黃曲霉毒素M1免疫親和柱適用于以下標準：
GB/T 18980-2003 乳和乳粉中黃曲霉毒素M1的測定-免疫親和層析凈化高效液相色譜法和熒光光度法
GB/T 5413.37-2010 乳和乳制品中黃曲霉毒素M1的測定
GB 5009.24-2016 食品安全國家標準 食品中黃曲霉毒素M族的測定
原理
樣品經前處理后，然后通過鍵合有黃曲霉毒素特殊抗體的免疫親和柱。此時，黃曲霉毒素M1被親和柱中的抗體特異性的吸附，用水或緩沖液將免疫親和柱上的雜質除去，然后用甲醇使抗體變性，從而將黃曲霉毒素M1從親和柱上洗脫下來。最后，用HPLC或熒光計進行定量檢測
儲存條件
該親和柱保存在2-8 °C條件下，絕對不能冷凍，保質期為18個月。建議在室溫（18-30°C）下使用。
實驗溶液制備
- HPLC流動相，水-乙腈-甲醇（68+24+8，v/v）：取240mL乙腈和80mL水甲醇加680mL水，混合均勻，用0.22微米的尼龍篩過濾。
- 標準溶液的配制：取黃曲霉毒素M1標準品，用流動相稀釋到所需工作濃度。
- 注：配制好的標準品溶液2-8℃冷藏保存有效期為24h。
液相色譜條件
色譜柱：Cloversil-C18 4.6*150mm（5um）或4.6*250mm（5um）
流動相：水-乙腈-甲醇（68+24+8，v/v）
流速：0.8mL/min
檢測器：熒光檢測器: 激發波長360nm,發射波長440nm
紫外檢測器：波長365nm（紫外檢測方法：建議標準曲線濃 度:5-50ng/ml）
進樣體積：20~100uL
分析步驟
1 新國標GB 5009.24-2016方法：
1.1 樣品提取及稀釋：
液態乳、酸奶：
稱取 4g 混合均勻的試樣(精確到 0.001g )于 50mL 離心管中, 加入 10mL 甲醇,渦旋 3min 。置于 4 ℃、6000r / min 離心10min 或經玻璃纖維濾紙過濾,將適量上清液或濾液轉移至燒杯中,加 40mL 水或 PBS 稀釋,備用。
乳粉、特殊膳食用食品：
稱取1g樣品(精確到0.001g)于50mL離心管中,加入4mL 50℃熱水,渦旋混勻。如果乳粉不能完全溶解,將離心管置于 50℃的水浴中,將乳粉完全溶解后取出。待樣液冷卻至20℃后,加入10mL甲醇,渦旋3min。置于 4℃、6000r/min下離心10min或經玻璃纖維濾紙過濾,將適量上清液或濾液轉移至燒杯中,加40mL 水或PBS稀釋,備用。
奶油：
稱取1g樣品(精確到0.001g)于50mL離心管中,加入8mL 石油醚,待奶油溶解,再加9mL 水和11mL 甲醇,振蕩30min,將全部液體移至分液漏斗中。加入0.3g氯化鈉充分搖動溶解,靜置分層后,將下層移到圓底 燒瓶中,旋轉蒸發至10mL以下,用PBS稀釋至30mL。
奶酪：
稱取1g已切細、過孔徑1mm~2mm 圓孔篩混勻樣品(精確到0.001g)于50mL離心管中,加入1mL水和18mL甲醇,振蕩30min,置于4℃、6000r/min下離心10min或經玻璃纖維濾紙過濾,將適量上清液或濾液轉移至圓 底燒瓶中,旋轉蒸發至2mL以下,用PBS稀釋至30mL。
1.2樣品的凈化
免疫親和柱內的液體放棄后,將上述樣液移至50mL注射器筒中,調節下滴流速為1mL/min~3mL/min。待樣液滴完后,往注射器筒內加入10mL水,以穩定流速淋洗免疫親和柱。待水滴完后,用真空泵抽干親和柱。脫離真空系統,在親和柱下放置10mL刻度試管,取下50mL的注射器筒,加入 2×2mL乙腈(或甲醇)洗脫親和柱,控制1mL/min~3mL/min下滴速度,用真空泵抽干親和柱,收集 全部洗脫液至刻度試管中。在50℃下氮氣緩緩地將洗脫液吹至近干,用初始流動相定容至1.0mL,渦 旋30s溶解殘留物,0.22μm 濾膜過濾,收集濾液于進樣瓶中以備進樣。
2 老國標方法：
2.1樣品提取及稀釋：
乳：
量取100mL混勻的試樣，置于兩個50 mL具塞離心管中，在水浴中加熱到35℃～37 ℃。在4000~6000 g下離心15 min。收集并混合上清液，用移液管移取50mL上清液供凈化處理用。
發酵乳(包括固體狀、半固體狀和帶果肉型)：
稱取100 g(精確至0.01 g)混勻的試樣，用0.5 mol/L 的氫氧化鈉溶液在酸度計指示下調pH至7.4，高速勻漿5 min。在4000~6000 g下離心15 min。收集并混合上清液，用移液管移取50mL上清液供凈化處理用。
乳粉和粉狀嬰幼兒配方食品：
稱取 10 g(精確至0.01 g)試樣，置于250 mL 燒杯中。將50 mL 已預熱到50 ℃的水加入到乳粉中，用玻璃棒將其混合均勻。如果乳粉仍未完全溶解，將燒杯置于50℃的水浴中放置30 min。溶解后冷卻至20 ℃，移入100 mL 容量瓶中，用少量的水分次洗滌燒杯，洗滌液一并移入容量瓶中，用水定容至刻度，搖勻后分別移至兩個50 mL離心管中，在4000~6000 g離心15 min，混合上清液，用移液管移取50mL上清液供凈化處理用。
干酪：
稱取經切細、過10目圓孔篩混勻的試樣5g(精確至0.01 g)，置于50 mL離心管中，加20 mL水和30 mL甲醇，高速勻漿5 min，超聲提取30 min，在4000~6000 g下離心15 min。收集上清液并移入250 mL分液漏斗中。在分液漏斗中加入30 mL石油醚振搖2 min，待分層后，將下層移于50 mL燒杯中，棄去石油醚層。重復用石油醚提取2次。將下層溶液移到100 mL圓底燒瓶中，減壓濃縮至約2 mL，濃縮液倒入離心管中，燒瓶用乙腈-水溶液(1+4) 5 mL分2次洗滌，洗滌液一并倒入50 mL離心管中，加水稀釋至約50 mL，在4000~6000 g下離心 5 min，上清液供凈化處理。
奶油：
稱取5g(精確至0.01 g)試樣，置于50 mL燒杯中，用20 mL石油醚將其溶解并移于250mL具塞錐形瓶中。加20 mL水和30 mL甲醇，振蕩30 min后，將全部液體移于分液漏斗中，待分層后，將下層溶液全部移到100 mL圓底燒瓶中，在旋轉蒸發儀中減壓濃縮至約5 mL，加水稀釋至約50mL，供凈化處理。
2.2樣品的凈化
將以上試液提取液移至50 mL 注射器筒中，調節固相萃取裝置的真空系統,控制試樣以1~2滴/秒穩定的流速過柱。取下50 mL 的注射器筒，裝上10 mL 注射器筒。注射器筒內加入水，以穩定的流速洗柱，然后，抽干親和柱。脫開真空系統，在親和柱下部放入10 mL 刻度試管，上部裝上另一個10 mL 注射器筒，加入4 mL 乙腈,洗脫黃曲霉毒素M1，洗脫液收集在刻度試管中，洗脫時間不少于60 秒。然后用氮氣緩緩地在30 ℃下將洗脫液蒸發至近干 (如果蒸發至干，會損失黃曲霉毒素M1 )，用流動相稀釋至1 mL。
注意事項
- 不要隨便更改操作說明書中的操作步驟，如需更改要和本公司技術部聯系，確認更改是否合理。
- 操作步驟中，樣品過柱，淋洗，洗脫時，一定要控制好流速，不能太快，否則會使檢測結果偏低。
- 如果將標準品直接過柱驗證回收率時，一定要確保標準上柱液中甲醇濃度不要超過20%，否則會影響柱子的吸附能力。
- 試驗中使用的玻璃儀器等，一定要清洗干凈，尤其是用次氯酸等處理過的儀器，否則會使檢測結果偏低。
- 當用氮氣濃縮洗脫液時，氮氣流不要太大，否則會損失部分黃曲霉毒素M1
需要準備的設備及試劑
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物品 |
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泵流操作架 |
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高速勻質器，轉速可達18,000 r/min ~22,000 r/min |
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微纖維濾紙（1.5um，100張/盒） |
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折疊式槽紋濾紙（100張/盒），或中速定性濾紙 |
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一次性塑料燒杯(25/包) |
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一次性測試管(250支/包) |
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塑料漏斗(10 個/包) |
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黃曲霉毒素M1標準品 |
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色譜純級的甲醇和乙腈（4升/瓶） |
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C18 反相色譜柱4.6*150mm（5um）或4.6*250mm（5um） |
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奶粉等基質含有不同水平黃曲霉毒素的質控樣品 |
