黃曲霉毒素B1免疫親和柱

使用對象

黃曲霉毒素B1免疫親和柱能夠特異性的純化與濃縮樣品中的黃曲霉毒素B1。黃曲霉毒素免疫親和柱廣泛地應用于糧食、食品、飼料、堅果、花生、醬油、醋、辣椒、胡椒、藥材和酒類等樣品的提取，該方法速度快、操作簡單、準確性高，對準確靈敏的測定樣品中中的黃曲霉毒素B1起到十分重要的作用。

黃曲霉毒素B1免疫親和柱適用于以下標準：

GB/T 18979-2003 食品中黃曲霉毒素的測定-免疫親和層析凈化高效液相色譜法和熒光光度法

SN/T 1101-2002 進出口油籽及糧谷中黃曲霉毒素的檢測方法

GBT 30955-2014 飼料中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的測定 免疫親和柱凈化-高效液相色譜法

GB/T5009.22-2016 食品中黃曲霉毒素B族和G族的測定

原理

樣品經提取液提取、過濾、稀釋，然后通過鍵合有黃曲霉毒素B1特殊抗體的免疫親和柱。此時，黃曲霉毒素被親和柱中的抗體特異性的吸附，用水或緩沖液將免疫親和柱上的雜質除去，然后用甲醇使抗體變性，從而將黃曲霉毒素B1從親和柱上洗脫下來。最后，用HPLC或熒光計進行定量檢測。

儲存條件

該親和柱保存在2-8 °C條件下，絕對不能冷凍，保質期為18個月。建議在室溫（18-30°C）下使用。

實驗溶液制備

• 提取液，甲醇/水（8+2）：取80mL甲醇加20mL水，混合均勻。
• 提取液，甲醇/水（7+3）：取70mL甲醇加30mL水，混合均勻。
• HPLC流動相，甲醇/水（45+55）：取450mL甲醇加550mL水，混合均勻，用0.22微米的尼龍篩過濾。
• 標準溶液的配制：取黃曲霉毒素B1標準品，流動相為稀釋液，配制標準品溶液。例如：取100uL標準品1000 ng/mL原液于10mL容量瓶中，用10mL流動相定容至10mL，那么，黃曲霉毒素B1為10ng/mL.

    注：配制好的標準品溶液2-8℃冷藏保存有效期為24h。

• pH 7.0 PBS溶液：稱取8.0g氯化鈉，1.44g磷酸氫二鈉，0.24g磷酸二氫鉀，0.2g氯化鉀，用990mL純水溶解，然后用濃鹽酸調節pH值至7.0，最后用純水稀釋至1000mL。
• 0.1%的吐溫/PBS：將1.0mL吐溫-20加入到1L pH 7.0 PBS溶液中，混勻。
• 1%Tween-20PBS或1%TritionX-100 PBS溶液：將10.0mL Tween-20或TritionX-100加入到1L pH 7.0 PBS溶液中，混勻。

液相色譜條件

色譜柱：C18 4.6*150mm（5um）或4.6*250mm（5um）

流動相：甲醇-水（45+55，v/v）

流速：0.8mL/min

檢測器：熒光檢測器，激發波長360nm,發射波長440nm

進樣體積：20~100uL

光化學衍生化系統：光化學衍生器有兩接口（不分進出），分別與色譜柱出口或熒光檢測器進口連接

分析步驟

1國標GB/T5009.22-2016 方法：

1.1樣品提取及稀釋：

一般固體樣品：

甲醇水提取法：準確稱取試樣5.0g于50mL離心管中，加準確加入20.0mL甲醇-水（7+3），以均質器高速攪拌提取3min或搖床震蕩20min。槽紋濾紙或普通濾紙過濾，準確移取8.0mL濾液并加入42.0mL1%Tween-20 PBS或1%TritionX-100PBS稀釋，用玻璃纖維濾紙過濾，至濾液澄清，量取25mL濾液備用。（該方法與國標方法部分改動，增加了玻璃纖維濾紙過濾；不過濾會出現堵柱子的現象）

乙腈水提取法：準確稱取試樣5.0g于50mL離心管中，加準確加入20.0mL乙腈-水（84+16），以均質器高速攪拌提取3min或搖床震蕩20min。槽紋濾紙過濾或6000RPM離心10min，準確移取4.0mL濾液并加入46.0mL1%Tween-20 PBS或1%TritionX-100PBS稀釋，備用。

1.2樣品的凈化

一般固體樣品：

    將免疫親和柱連接于50.0mL玻璃注射器下。準確處理好的樣品濾液注入玻璃注射器中，將空氣壓力泵與玻璃注射器連接，調節壓力使溶液以約2mL/min（1滴/秒）流速緩慢通過免疫親和柱，直至2~3mL空氣通過柱體。以2-3mL/min（1-2滴/秒）流速用10.0mL水淋洗柱子2次，棄去全部流出液，并使2mL~3mL空氣通過柱體。準確加入2.0mL色譜級甲醇洗脫，將2.0mL淋洗液在50℃氮氣下吹干，用1mL流動相定容后，混勻，注入HPLC檢測。

2老國標方法：

2.1樣品提取及稀釋：

大米、玉米、小麥、堅果、調料、花生及其制品：

準確稱取試樣25.0g于250mL具塞錐形瓶中，加入5.0g氯化鈉及準確加入125.0mL甲醇-水（7+3），以均質器高速攪拌提取2min。槽紋濾紙過濾，準確移取15.0mL濾液并加入30.0mL水稀釋，用玻璃纖維濾紙過濾，至濾液澄清，備用。

植物油脂：

準確稱取試樣25.0g于250mL具塞錐形瓶中，加入5.0g氯化鈉及入125.0mL甲醇-水（7+3），以均質器高速攪拌提取2min。槽紋濾紙過濾，準確移取15.0mL濾液并加入30.0mL水稀釋，用玻璃纖維濾紙過濾，至濾液澄清，備用。

醬油：

稱取試樣50.0g于250.0mL具塞錐形瓶中，加入2.5g氯化鈉及加入甲醇-水（8+2）至100.0mL，以均質器高速攪拌提取1min。槽紋濾紙過濾，準確移取10.0mL濾液并加入40.0mL水稀釋，用玻璃纖維濾紙過濾，至濾液澄清，備用。

食醋：

準確稱取5.0g樣品，加入1.0g氯化鈉，以pH7.0磷酸鹽緩沖溶液稀釋至25.0mL，混勻，定量濾紙過濾。取10.0mL濾液加入10.0mL pH7.0磷酸鹽緩沖溶液，混勻。以玻璃纖維濾紙過濾，至濾液澄清，備用。

飼料：

準確稱取試樣50.0g于250mL具塞錐形瓶中，加入5.0g氯化鈉及入100.0mL甲醇-水（8+2），以均質器高速攪拌提取2min。槽紋濾紙過濾，準確移取10.0mL濾液并加入40.0mL pH7.0 PBS稀釋，用玻璃纖維濾紙過濾，至濾液澄清，備用。

2.2 樣品的凈化

黃曲霉毒素B1免疫親和柱的柱容量(最大吸附黃曲霉毒素B1量)為300ng，當樣品中黃曲霉毒素超過測定范圍時，請適當減小上柱體積，使其在檢測范圍內，計算出準確含量。

大米、玉米、小麥、堅果、調料、花生及其制品、植物油脂：

    將免疫親和柱連接于20.0mL玻璃注射器下。準確移取15.0mL樣品提取液注入玻璃注射器中，將空氣壓力泵與玻璃注射器連接，調節壓力使溶液以約2mL/min（1滴/秒）流速緩慢通過免疫親和柱，直至2~3mL空氣通過柱體。以2-3mL/min（1-2滴/秒）流速用10.0mL水淋洗柱子2次，棄去全部流出液，并使2mL~3mL空氣通過柱體。準確加入2.0mL色譜級甲醇洗脫，流速為1 mL/min ~2mL/min（1滴/秒），收集全部洗脫液于玻璃試管中，供檢測用。

醬油和食醋： 

 將免疫親和柱連接于10.0mL玻璃注射器下。準確移取10mL樣品提取液注入玻璃注射器中，將空氣壓力泵與玻璃注射器連接，調節壓力使溶液以約2mL/min（1滴/秒）流速緩慢通過免疫親和柱。以2-3mL/min（1-2滴/秒）流速用10.0mL 0.1%的吐溫/PBS清洗，再以10.0mL水清洗柱子2次，棄去全部流出液，并使2 mL~3mL空氣通過柱體。準確加入2.0mL色譜級甲醇洗脫，流速為1mL/min~2mL/min（1滴/秒），收集全部洗脫液于玻璃試管中，供檢測用。

飼料：

將免疫親和柱連接于10.0mL玻璃注射器下。準確移取10mL樣品提取液注入玻璃注射器中，將空氣壓力泵與玻璃注射器連接，調節壓力使溶液以約2mL/min（1滴/秒）流速緩慢通過免疫親和柱。以2-3mL/min（1-2滴/秒）流速用10.0mL水清洗柱子2次，棄去全部流出液，并使2 mL~3mL空氣通過柱體。準確加入2.0mL色譜級甲醇洗脫，流速為1mL/min~2mL/min（1滴/秒），收集全部洗脫液于玻璃試管中，供檢測用。

高效液相色譜儀檢測黃曲霉毒素B1的標準譜圖

注意事項

• 樣品添加回收試驗時，標準品添加到樣品中，靜置2小時后或過夜，再進行樣品前處理，否則會出現回收率偏低的現象。
• 不要隨便更改操作說明書中的操作步驟，如需更改要和本公司技術部聯系，確認更改是否合理。
• 操作步驟中，樣品過柱，淋洗，洗脫時，一定要控制好流速，不能太快，否則會使檢測結果偏低。
• 如果將標準品直接過柱驗證回收率時，一定要確保標準上柱液中甲醇濃度不要超過25%，否則會影響柱子的吸附能力。
• 試驗中使用的玻璃儀器等，一定要清洗干凈，尤其是用次氯酸等處理過的儀器，否則會使檢測結果偏低。

   需要準備的設備及試劑

物品

光化學衍生器

泵流操作架

高速勻質器，轉速可達18,000 r/min ~22,000 r/min

微纖維濾紙（1.5um，100張/盒）

折疊式槽紋濾紙（100張/盒），或中速定性濾紙

一次性塑料燒杯(25/包)

一次性測試管(250支/包)

塑料漏斗(10 個/包)

黃曲霉毒素混合標準品

色譜純級的甲醇和乙腈

C18 反相色譜柱4.6*150mm（5um）或4.6*250mm（5um）

玉米、飼料等基質含有不同水平黃曲霉毒素的質控樣品